יישומים בביוטכנולוגיה

פרוייקט גמר באוניברסיטת אריאל

נושא המחקר: “חקר פעילות אנטי-סרטנית של פפטיד ציקלי חדשני AFP הקושר אינטגרין αVβ3”

מטרת המחקר: פיתוח טיפול למלנומה גרורתית. הטיפולים הקיימים למלנומה נותנים מענה חלקי בלבד ואינם יעילים לחלק ניכר מהחולים במחלה. לפיכך, קיים צורך אמיתי בפיתוח תרופה יעילה.
האינטגרין αVβ3 המבוטא על ביתר גבי תאים סרטניים מהווה אתר מטרה ספציפי לתרופה פוטנציאלית אשר אינה פוגעת בתאים נורמאליים. מניפולציות חוץ תאיות על האינטגרין ישנו את אופי פעילותו המתווכת המשפיעה על מספר מאפיינים הכרחיים להתקדמות הסרטן כגון נדידת תאים (מטאסטאזיס), בקרה על מחזור חיי התא (פרוליפרציה), התמיינות, אנגיוגנזה (יצירת כלי-דם חדשים) ועוד.

שיטות:

1. RTPCR

2. Bradford- שיטה לכימות חלבונים בליזאט.

3. Western blot- אלקטרופורזה של חלבונים, הספגה וטיפול בנוגדנים.

4. Viability assay- בדיקת חיות התאים על ידי Neutral Red.

5. עבודה עם תרביות תאים.

* יתכנו שינויים בסוגי התרופות, סוגי התאים ושאלות המחקר האישיות.

ניסוי 1:

:בדיקת רמות אינטגרין הנבדק בין סוגי תאי סרטן שונים

באמצעות שיטת Real-Time PCR נבדוק את רמות הביטוי של האינטגרין αVβ3 בתרביות תאים מהסוגים הבאים:

1. B16F10- סרטן עור גרורתי ממקור עכברי

2. B16F1- סרטן עור גרורתי אגרסיבי ממקור עכברי

3. 4T1- סרטן שד ממקור עכברי

4. LLC1- סרטן ריאות ממקור עכברי

5. תאים בריאים- (Mouse embryonic fibroblast (mef

6. מים- ביקורת

*6 דופליקטים

מטרה: לבדוק האם רמת ביטוי האינטגרין αVβ3 גבוהה יותר בתאים מסויימים מאשר באחרים.

ניסוי 2:

השפעת הפפטיד AFP4 על ביטוי החלבון האקטיבי pERK בתאי סרטן שונים: B16F1, 4T1, B16F10, LLC1.

קישור ליגנד לאינטגרינים מפעיל שרשרת מסלולים תוך תאיים שבסופם הופך החלבון ERK הלא פעיל לחלבון pERK הפעיל על ידי פוספורילציה. חלבון pERK הפעיל נכנס לגרעין ופועל כפקטור שיעתוק על גנים הקשורים להגברת חלוקה, שרידות ונדידת התא, ובכך הוא מסייע להתקדמות התהליך הסרטני. הפפטיד AFP4 נקשר לאינטגרינים ומונע את קישור הליגנד. התרופה יעילה יותר ככל שיופיע פחות חלבון pERK פעיל בתא.

רמת ביטוי החלבון pERK תבדק בשיטת Western blot הכוללת הכנת עקומת כיול לקביעת ריכוז חלבון בשיטת ברדפורד. התלמידים יקבלו סוגי תאים סרטניים שונים שעברו טיפול בפפטיד AFP4 למשך 24 שעות וכן אותם תאים שטופלו בסליין כביקורת. בנוסף ייבדק בשיטה זו חלבון שרמתו קבועה בתאים (Housekeeping gene) החלבון טובולין, לבדוק שהשינוי הנראה נובע מפעילות התרופה ולא משוני בריכוז החלבון.

מטרה: השוואה של כמות pERK בתאים סרטניים שטופלו ב-AFP4 לעומת תאים סרטניים שטופלו בסליין כביקורת.

שלבים Western Blot:

• הכנת ליזאט התאים

• קביעת ריכוז חלבון בשיטת ברדפורד

• הכנת ג’ל פוליאקרילאמיד

• הטענת הדוגמאות בג’ל

• הרצה של הדוגמאות בג’ל

• הספגה (transfer- העברת החלבונים לממברנת ניטרוצלולוז)

• צביעת פונסיאו

• חסימת אתרים פנויים בממברנה (Blocking)- חסימה על ידי Dry Milk

• הוספת נוגדן ראשוני הנקשר לאנטיגן המבוקש

• הוספת נוגדן שניוני מסומן אנזימטית

• הוספת סובסטרט ופיתוח במכונה

• ניתן לכמת את עוצמת הצבע באמצעות תוכנת imageJ

ניסוי 3:

השפעת הפפטיד AFP, תרופה כימותרפית והתצמיד שלהם, על החיות של תאי סרטן מסוגים שונים. הבדיקה בשיטת Neutral Red.

סוגי התרופות הכימותרפיות:

1. (Camptothecin (CPT- מעכב את האנזים טופואיזומרז I
2. (DoxoRubicin (DOXO- מעכב את האנזים טופואיזומרז II
3. (Mitoxatrone (MTX- מעכב את האנזים טופואיזומרז II
4. (TSC24 (TSC- מעכב את האנזים טופואיזומרז II אלפא

סוגי תאים:

1. B16F10- סרטן עור גרורתי ממקור עכברי
2. B16F1- סרטן עור גרורתי אגרסיבי ממקור עכברי
3. 4T1- סרטן שד ממקור עכברי
4. LLC1- סרטן ריאות ממקור עכברי

Neutral Red, חומר שמשתמשים בו לצביעה של רקמות, נכנס לליזוזומים של תאים חיים בלבד. לתאים מתים אין יכולת לספוח את המולקולה.

הבדיקה נעשית בפלטות אלייזה (96 בארות) לגידול תאים. התלמידים מטפלים בתאים הנמצאים בבארות בטיפולים שונים על פי שאלת המחקר. בסוף הטיפול מוסיפים Neutral Red לבארות ומדגירים ל-4 שעות באינקובטור. לאחר מכן שוטפים את התאים 3 פעמים עם PBS כדי להוציא את הצבע שלא חדר לתאים, ומפוצצים את ממברנת התאים עם תמיסה המכילה אתנול וחומצה אצטית. מודדים את בליעת הצבע שהשתחרר מהתאים לבארית ב- ELISA READER באורך גל של 540 ננומטר.

מטרה: לבדוק איך הטיפולים השונים (פפטיד, תרופה ותצמיד) משפיעים על חיות התאים.

דוגמא לשאלות מחקר:

1. פעולתם האנטי-סרטנית של תרופות ניסיוניות (AFP, DOXO, DOXO+AFP) בתאי B16F10 במינונים שונים (1,5,10,20,30µM) לאחר 24 שעות טיפול.
2. פעולתם האנטי-סרטנית של תרופות ניסיוניות (AFP, DOXO, DOXO+AFP) בתאי B16F1 במינונים שונים (1,5,10,20,30µM) לאחר 24 שעות טיפול.
3. פעולתם האנטי-סרטנית של תרופות ניסיוניות (AFP, DOXO, DOXO+AFP) בתאי 4T1 במינונים שונים (1,5,10,20,30µM) לאחר 24 שעות טיפול.
4. פעולתם האנטי-סרטנית של תרופות ניסיוניות (AFP, DOXO, DOXO+AFP) בתאי LLC1 במינונים שונים (1,5,10,20,30µM) לאחר 24 שעות טיפול.

• כל הבדיקות נעשות בטריפליקטים.
• לכל ניסוי יש ביקורות מתאימות.

מאמרי חובה:

אוניברסיטת אריאל בשומרון, הפקולטה למדעי החיים
המחלקה לביולוגיה מולקולארית

נושא המחקר: “חקר פעילות אנטי-סרטנית של פפטיד ציקלי חדשני הקושר אינטגרין αVβ3“